Современным методом определения нуклеотидной последовательности ДНК является метод обрыва цепи (англ. chain termination method). Прежде всего фрагмент ДНК клонируют в фаге М13 (см. Вирусы), из которого легко выделяют однонитевую ДНК (а). Её гибридизуют с короткой ДНК, называемой праймером, которая связывается с 3′-концом однонитевой ДНК (б). Затем к полученной матрице добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата дНТФ (dNTP): дАТФ (dATP), дГТФ (dGTP), дТГФ (dTGP) и дЦТФ (dCTP). Кроме дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в реакционную смесь добавляют один из четырёх дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов [ддНТФ (ddNTP)] (см. схему). Затем с помощью ДНК-полимеразы ведут синтез второй (комплементарной) цепи ДНК.
Остановка синтеза (обрыв цепи) будет происходить всякий раз, когда вместо дНТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему ддНТФ. На схеме принцип метода демонстрируется на примере с ддГТФ. В этом случае образуются фрагменты, которые включают праймер плюс 3, 6, 8, 13 или 14 других нуклеотидов. Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из четырёх ддНТФ (в). Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез (г) (см. Методы выделения и анализа белков). Длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи.
Как только фрагменты ДНК визуализированы (д), нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очерёдностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных «дорожках» (е). Реальная электрофореграмма с четырьмя дорожками приведена на рис. 2. При оптимальных условиях с помощью метода обрыва цепи можно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни нуклеотидов.
Остановка синтеза (обрыв цепи) будет происходить всякий раз, когда вместо дНТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему ддНТФ. На схеме принцип метода демонстрируется на примере с ддГТФ. В этом случае образуются фрагменты, которые включают праймер плюс 3, 6, 8, 13 или 14 других нуклеотидов. Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из четырёх ддНТФ (в). Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез (г) (см. Методы выделения и анализа белков). Длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи.
Как только фрагменты ДНК визуализированы (д), нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очерёдностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных «дорожках» (е). Реальная электрофореграмма с четырьмя дорожками приведена на рис. 2. При оптимальных условиях с помощью метода обрыва цепи можно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни нуклеотидов.
Статьи раздела «Секвенирование ДНК»:
- А. Библиотеки
- Б. Секвенирование ДНК
Структура:
Списки:
Сложность материала:
Величины и единицы:
Книги Список книг
Биофизическая химия (комплект из 2 книг) В трёхтомном издании, написанном учёными из США, на самом современном уровне ...
Molecular Biology of the Cell: The Problems Book The Problems Book helps students appreciate the ways in which experiments and simple calculations can lead to an understanding of how cells work by ...
NMR Studies of Structural Motifs: Protein Folding and Ligand Binding NMR of Structural Motifs: The agrin G3 domain is critical in development and maintenance of the neuromuscular junction. G3 binds -dystroglycan and ...
