В генной инженерии часто требуется выделить отдельный, пока ещё не охарактеризованный фрагмент ДНК (DNA), например, с целью определения его полной нуклеотидной последовательности. Такая задача решается путём создания библиотек кДНК. Библиотека ДНК состоит из большого количества векторных молекул ДНК, содержащих различные фрагменты чужеродной ДНК. Например, возможно получить все молекулы мРНК клетки в виде фрагментов ДНК — кДНК (англ. complementary DNA, cDNA) — и произвольно внедрить эти копии в векторные молекулы. Библиотека генов может быть получена путём расщепления ДНК клетки на небольшие фрагменты рестриктазами (см. Клонирование ДНК) и последующего встраивания этих фрагментов в векторную ДНК. В качестве векторов для получения библиотек ДНК используются бактериофаги (сокращённо: фаги). Фаги — это вирусы, которые инфицируют бактерии, где их геном реплицируется вместе с бактериальным геномом (см. Вирусы). Библиотеки генов удобны тем, что в них легко вести поиск необходимых в данный момент фрагментов.
Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (105-106 фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду. Бактерии определённое время растут, образуя на питательной среде плотный мутный слой клеток. При этом бактерии, заражённые фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек». Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают. Если теперь инкубировать фильтр с меченым олигонуклеотидным зондом, соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдёт гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК. Место связывания зонда можно определить по радиоактивной или иной метке. После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшек и размножают обычным образом. Большие количества необходимого фрагмента получают с помощью расщепления ДНК рестриктазами.
Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (105-106 фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду. Бактерии определённое время растут, образуя на питательной среде плотный мутный слой клеток. При этом бактерии, заражённые фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек». Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают. Если теперь инкубировать фильтр с меченым олигонуклеотидным зондом, соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдёт гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК. Место связывания зонда можно определить по радиоактивной или иной метке. После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшек и размножают обычным образом. Большие количества необходимого фрагмента получают с помощью расщепления ДНК рестриктазами.
Статьи раздела «Секвенирование ДНК»:
- А. Библиотеки
- Б. Секвенирование ДНК
Структура:
Списки:
Сложность материала:
Величины и единицы:
Книги Список книг
Practical Forensic Microscopy: A Laboratory Manual Forensic Microscopy: A Laboratory Manual will provide the student with a practical overview and understanding of the various microscopes and ...
Yeast: Molecular and Cell Biology Yeast is one of the oldest domesticated organisms and has both industrial and domestic applications. In addition, it is very widely used as a ...
Молекулярная и клеточная биология (комплект из 3 книг) В книге известного учёного ФРГ на самом современном уровне обсуждены последние ...
Gene Control Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive ...