А. Выделение клеточных органелл

Разработан ряд методик для исследования изолированных отделов клетки. Для того чтобы выделить клеточные органеллы, исследуемый образец измельчают и затем гомогенизируют в забуференной среде с использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема (тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который особенно предпочтителен для выделения лабильных молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения клеток включают ферментативный лизис, разрушающий клеточные стенки, или механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания).

Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, то есть осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.

Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с2, см. Центрифугирование) приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером.

Ядро седиментирует уже при ускорении, достигаемом с помощью настольных центрифуг. Декантирование супернатанта и тщательное повторное ресуспендирование осадка даёт фракцию, обогащённую клеточными ядрами. Однако эта фракция всё ещё содержит другие клеточные компоненты в качестве примесей, например фрагменты цитоскелета.

Частицы меньших размеров и менее плотные, чем ядро, получают при воздействии на супернатант постепенно увеличивающегося ускорения . Эта операция проводится на более мощных центрифугах, таких, как высокоскоростные центрифуги с охлаждением и ультрацентрифуги. Порядок осаждения фракций следующий: митохондрии, затем мембранные пузырьки (везикулы) и рибосомы. Супернатант последнего центрифугирования представляет собой «цитозоль», то есть растворимые компоненты клетки, перешедшие при гомогенизации ткани в буферный раствор.

Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0-5 °С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счёт реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.


Организация клетки. Структура клеток / Фракционирование клеточных структур

Статьи раздела «Фракционирование клеточных структур»:

Следущая статья   |   — Вернуться в раздел


Handbook of Nanoindentation: With Biological Applications / Broadly divided into two parts, this guide’s first part presents the a’basic sciencea’ of nanoindentation, including the background of contact mechanics underlying indentation technique, and the instrumentation used to gather mechanical data. Both the mechanics background and the instrumentation oveHandbook of Nanoindentation: With Biological Applications
Broadly divided into two parts, this guide’s first part presents the a’basic sciencea’ of nanoindentation, including the background of contact ...
Gene Control / Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive primary literature into an easily accessible format. Gene Control will be of value to students in biological sciences, as well as to scientists and cliniGene Control
Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive ...
Биокатализ и биокатализаторы. Исторический очерк / Книга посвящена истории возникновения и развития двух основных проблем энзимологии — природы биокаталитических процессов и химической природы биокатализаторов. В ней впервые проанализированы условия формирования энзимологии. Дан очерк основных проблем энзимологии. В монографии собран большой фактичеБиокатализ и биокатализаторы. Исторический очерк
Книга посвящена истории возникновения и развития двух основных проблем ...
История биологической химии. Институционализация биохимии / Книга посвящена вопросам истории формирования научных организаций в области классической биохимии. Показано, как возникли периодическая печать, руководства и учебники, научные общества, институты и кафедры биохимического профиля. На основании обширного, впервые проанализированного материала показаноИстория биологической химии. Институционализация биохимии
Книга посвящена вопросам истории формирования научных организаций в области ...